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单克隆分离技术主要包括有限稀释法、克隆环法和显微操作法。有限稀释法是通过将细胞悬液连续梯度稀释，使最终在细胞培养板的一个孔中仅有1个细胞，再经过两周左右时间增殖，形成细胞群，再经过验证获得稳定克隆。
克隆环法是通过在10-15cm的细胞培养皿中，将细胞接种低密度，使分散的单个细胞各自增殖成细胞群，用克隆环方式与周围的细胞隔离开，通过胰酶消化，转到新的孔板中继续培养扩增，并检测验证而获得稳定克隆；显微操作法是借助显微镜，在放大的视野下挑取单细胞，再转至培养孔中，逐渐扩增获得单克隆。
这三种方法有各自一定的局限性：有限稀释法对悬浮细胞较为合适，但是实际中贴壁细胞的需求占绝大多少，而且很多细胞在极低密度下生长极慢甚至不能生长，无法进行单细胞克隆；克隆环法不仅需要购买克隆环，而且因为细胞数量较少时肉眼难辨，必须等到细胞数量扩增到几百时才能进行分离，因此需要等待较长时间，而且操作步骤多、难度大，实验人员通常需要有丰富经验；显微操作法需要借助昂贵的特殊显微镜或将常规显微镜搬至安全柜内使用，操作难度加大，而且易造成细胞污染而前功尽弃。
单克隆分离方法：
a、在培养皿中制备饲养细胞（小鼠腹腔细胞）单层。
b、临用前将2.0%琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的HT培养液混匀，配成1%琼脂糖培养液，45℃水浴中温育。
c、吸去平皿上层培养液，加入1%琼脂糖培养液3ml，室温10分钟。
d、取杂交瘤细胞悬液1ml，加入1%琼脂糖培养液1ml混匀，铺于上层。
e、37℃、7.5%湿润培养7-14天；克隆生长至2mm时，用毛细吸管吸出克隆，直接转种于含有饲养细胞的24孔板，扩大培养。
f、吸取上清，检测抗体，阳性孔可继续克隆化，或扩大培养、冻存。
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